Bases moleculares do efeito do pH na atividade catalítica de duas lisozimas digestivas de Musca domestica (Diptera) (2008)
- Authors:
- Autor USP: CANÇADO, FABIANE CHAVES - IQ
- Unidade: IQ
- Sigla do Departamento: QBQ
- Subjects: LISOZIMAS; DIGESTÃO ANIMAL; INSETOS (ENZIMOLOGIA;ESTUDO); BIOLOGIA MOLECULAR; PROTEÍNAS (ESTRUTURA)
- Language: Português
- Abstract: Lisozimas são enzimas que fazem parte do mecanismo de defesa contra bactérias, no entanto lisozimas com função digestiva também são encontradas no trato digestivo de vertebrados e no intestino médio de insetos. As Iisozimas digestivas de insetos são do tipo "c" e assim compartilham semelhanças estruturais e mecanísticas com a lisozima da clara de ovo de galinha (HEWL). Entretanto, para desempenhar sua função digestiva, as lisozimas de insetos apresentam algumas propriedades particulares entre as quais se destaca um pH ótimo mais ácido em relação às lisozimas não-digestivas. Para elucidar as bases moleculares dessa diferença no pH ótimo, duas lisozimas digestivas (lisozima 1 - AAQ20048 e lisozima 2 - AAQ20047) da larva de Musca domestica (mosca - Diptera Cyclorrhapha), clonadas em Pichia pastoris e purificadas, foram caracterizadas estruturalmente e cineticamente com o substrato sintético (MUQ3) e natural (cápsulas de Micrococcus lysodeiktícus). Foi observado que o efeito do pH na atividade das lisozimas 1 e 2 sobre o MUQ3 é uma curva com formato de sino e pH ótimo mais ácido que o da HEWL. Essas curvas foram reflexos da diminuição simultânea dos valores de p'K IND.a's do nucleófilo e do doador de prótons. Estruturas cristalográficas das lisozimas digestivas de Musca domestica foram obtidas a 1,9 'ALFA' e análise comparativa com a estrutura terciária da HEWL revelou resíduos de aminoácidos no ambiente do nucleófilo ('N IND.46') e do doador de prótons (S106 eT107) que podem estar envolvidos na modulação das constantes de ionização dos resíduos essenciais à catálise. Esses resíduos foram substituídos via mutagênese sítio-dirigida por D, V e A respectivamente e três mutantes simples (N46D, S106V e T107A) e um triplo ('N IND.46'D- 'S IND.106'V-'T IND.107' A) foram produzidos e purificados. Caracterização revelou que as contribuições individuais da 'N IND.46', 'S IND.106' e 'T IND.107' ) foram pequenas e próximas do limite de detecção da técnica utilizada. Por outro lado, o conjunto dos 3 aminoácidos foi responsável pelo pH ótimo ácido frente ao substrato sintético, elevando os valores de p'K IND.a's do nucleófilo e doador de prótons para valores muito semelhantes ao da HEWL. Diferentemente, essa tripla mutação não foi suficiente para elevar o pH ótimo da lisozima 2 sobre cápsulas de Micrococcus lysodeikticus para valores próximos àqueles de HEWL, sugerindo que as bases moleculares do pH ótimo frente ao substrato natural e sintético são diferentes. Uma comparação estrutural entre lisozima 1 e HEWL sugere que os resíduos de aminoácidos carregados na superfície dessas lisozimas sejam importantes para determinação do pH ótimo. A investigação dessa hipótese foi feita substituindo 5 aminoácidos neutros e 1 ácido, via mutagênese sítio-dirigida, por resíduos básicos. A caracterização do mutante sêxtuplo revelou um aumento significativo nos valores de pH ótimo da lisozima 1, indicando que a redução da basicidade da superfície daslisozimas digestivas é determinante para seus pHs ótimos ácidos
- Imprenta:
- Data da defesa: 16.12.2008
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ABNT
CANÇADO, Fabiane Chaves. Bases moleculares do efeito do pH na atividade catalítica de duas lisozimas digestivas de Musca domestica (Diptera). 2008. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-22122008-094319/. Acesso em: 26 abr. 2024. -
APA
Cançado, F. C. (2008). Bases moleculares do efeito do pH na atividade catalítica de duas lisozimas digestivas de Musca domestica (Diptera) (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-22122008-094319/ -
NLM
Cançado FC. Bases moleculares do efeito do pH na atividade catalítica de duas lisozimas digestivas de Musca domestica (Diptera) [Internet]. 2008 ;[citado 2024 abr. 26 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-22122008-094319/ -
Vancouver
Cançado FC. Bases moleculares do efeito do pH na atividade catalítica de duas lisozimas digestivas de Musca domestica (Diptera) [Internet]. 2008 ;[citado 2024 abr. 26 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-22122008-094319/
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