Alfa Manosidases intestinais da larva de Tenebrio molitor (Coleoptera) (2008)
- Authors:
- Autor USP: MOREIRA, NATHÁLIA RAMALHO - IQ
- Unidade: IQ
- Sigla do Departamento: QBQ
- Subjects: BIOQUÍMICA ANIMAL; INSETOS (METABOLISMO); DIGESTÃO ANIMAL; COLEOPTERA; ENZIMAS
- Language: Português
- Abstract: Os estudos da função intestinal foram particularmente estimulados após a conscientização de que o tubo digestivo é uma enorme interface relativamente pouco protegida entre o inseto e o meio ambiente e pode ser usado como alvo para controle de pragas. Neste contexto, nosso trabalho envolve a purificação e caracterização de uma ´ALFA`-manosidase solúvel e a detecção de uma ´ALFA´-manosidase de membrana. As ´ALFA`-manosidases pertencem a uma família de exoglicosidases as quais hidrolisam resíduos de ´ALFA`-D-manosil a partir de terminais não redutores de oligossacarídeos. Estas enzimas são implicadas no catabolismo de carboidratos e na via de N-glicosilação protéica em insetos, mas pouco se sabe sobre a bioquímica destas glicosidases. 0 Tenebrio molitor é um Coleoptera bastante estudado pelo nosso laboratório devido a sua relevância como praga agrícola e o seu posicionamento em um ponto estratégico da árvore filogenética de insetos. O estudo de distribuição desta enzima mostrou que a ´ALFA`-manosidase encontra-se, principalmente, como uma enzima solúvel no conteúdo anterior e médio do intestino médio), mas também existe uma atividade significante na fração de membrana. Para confirmar a existência desta enzima de membrana, microvilosidades foram purificadas por precipitação diferencial com cálcio. A enzima aminopeptidase foi ,utilizada como marcadora, uma vez que sabe-se que esta enzima e uma típica de membrana microvilar. Como a ´ALFA`-manosidase solúvelé majoritária demos inicio a sua purificação e posterior caracterização. A sua purificação foi realizada utilizando uma combinação de quatro passos de cromatografia: Uma de troca iônica em Hitrap Q XL (Amersham/Bioscience), duas filtrações em gel, uma em Superdex 75 e outra em Superdex 200 (Amersham/Bioscience) usando o sistema AKTA, e o último passo e uma hidrofóbica em Phenyl Superose. Nós observamos a presença de dois picos de atividade nomeados de ) Man 1 e Man 2, sugerindo a existência de duas amanosidases solúveis, que se diferem quanto a hidrofobicidade. O pH ótimo das amanosidases é de 5,6 e sua massa molecular, determinada por cromatografia de filtração em gel, e de 123 kDa, e no SDS-PAGE observamos uma única banda de 70 KDa, indicando a existência de duas subunidades. Em um gel nativo revelado com o substrato fluorescente (metilumbelliferil-´ALFA`-D-manopiranosideo) nota-se somente uma banda de atividade.A Man 2 possui pl de 3,38. ´ALFA`-manosidases de T. molitor seguem a cinética de Michaelis-Menten com Km para o substrato p-nitrofenil-´ALFA`-Dmanopiranosideo de 0,84 ´MILIMOL` para Man 1 e 0,62 ´ALFA` para Man 2. Também foram feitos ensaios de inibição com dois inibidores que sabidamente inibem carboidrases, um é o deoximanojirimicina e o outro é a swainsonina. O Ki encontrado para o primeiro inibidor foi de 0,12 ´ALFA` para Man 1 e 0,15 ´ALFA` para Man 2 e o Ki para o segundo inibidor foi de 67,8 ´NANOMOL` para Man 1 e 63 ´NANOMOL` paraMan 2, sendo ambos inibidores competitivos. O fato destas enzimas serem inibidas apenas por ,Swainsonina em concentrações razoáveis, permite a sua classificação como tipo II. Isso sugere que elas são derivadas da forma lisossôrmica, embora apresente pH ótimo alterado
- Imprenta:
- Data da defesa: 19.09.2008
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ABNT
MOREIRA, Nathália Ramalho. Alfa Manosidases intestinais da larva de Tenebrio molitor (Coleoptera). 2008. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-27112008-102556/. Acesso em: 19 set. 2024. -
APA
Moreira, N. R. (2008). Alfa Manosidases intestinais da larva de Tenebrio molitor (Coleoptera) (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-27112008-102556/ -
NLM
Moreira NR. Alfa Manosidases intestinais da larva de Tenebrio molitor (Coleoptera) [Internet]. 2008 ;[citado 2024 set. 19 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-27112008-102556/ -
Vancouver
Moreira NR. Alfa Manosidases intestinais da larva de Tenebrio molitor (Coleoptera) [Internet]. 2008 ;[citado 2024 set. 19 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-27112008-102556/
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