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Tese

Trealases de malbranchea pulchella var. sulfurea: purificação, propriedades e efetores (2007)

  • Autores:
  • Autor USP: PEREIRA, MARITA GIMENEZ - FFCLRP
  • Unidade: FFCLRP
  • Sigla do Departamento: 592
  • Assunto: ENZIMAS (ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO)
  • Idioma: Português
  • Resumo: Trealases são enzimas largamente distribuídas nos organismos e são altamente específicas, hidrolisando somente trealose. No passado foram divididas em dois grupos, ácidas e neutras, considerando o seu pH de atuação. Apesar da estrita especificidade, as trealases das diferentes fontes exibem uma grande diversidade de propriedades bioquímicas. Atualmente é evidente que a simples divisão em ácidas e neutras não é mais satisfatória. Sabe-se que em fungos termófilos há fortes evidencias da existência de um grupo intermediário de trealase, com características mistas, de ácidas e de neutras. Em fungos filamentosos, as trealases ácidas são glicoproteínas termo-resistentes e sua atividade são pouco influenciadas por íons ou outras moléculas. As trealases neutras não são glicoproteícas, são mais lábeis que as ácidas, de localização intracelular, atuam sobre o "pool" endógeno de trealose e são muito influenciadas por íons e fosforilação dependente de PKA. O fungo Malbranchea pulchella é termofílico e vive normalmente na decompostagem entre os demais termófilos e é pouco estudado do ponto de vista fisiológico e bioquímico. O objetivo desse trabalho foi purificar e caracterizar as trealases intra e extracelular deste fungo, visando a comparação com as trealases de outros termófilos. Esse fungo cresce melhor em meio contendo amido e/ou maltose como fonte de carbono. A enzima é produzida com mais eficácia em incubadora que movimenta os frascos por excursão. Oprocesso de purificação consistiu em cromatografia da enzima extracelular em coluna de DEAE-Celulose pH 7,0, seguida da cromatografia em uma coluna hidrofóbica de Phenyl-Sepharose pH 7,0 e re-cromatografia em uma DEAE-Celulose pH 5,0. A enzima foi purificada 33,7 vezes, com uma atividade específica de 84,50 U/mg de proteína e um rendimento de 6%. A análise em PAGE e SDS-PAGE mostrou uma única banda de proteína de aproximadamente 52 kDa, e a massa molecular foi estimada por filtração em 104 kDa. A atividade máxima foi conseguida em pH 5,0, na temperatura de 55°C. A trealase intracelular foi purificada com dois passos. O processo de purificação consistiu em aplicação da enzima intracelular em coluna de DEAE- Celulose pH 7,0, seguida da aplicação do "pool" de DEAE em uma coluna hidrofóbica de Phenyl-Sepharose pH 7,0. A enzima foi purificada 24 vezes, com uma atividade específica de 50 U/mg de proteína e um rendimento de 21 %. A análise em PAGE e SDS-PAGE mostrou uma única banda de proteína de aproximadamente 50 kDa, e a massa molecular foi estimada por filtração em 150 kDa. A atividade máxima foi conseguida em pH 5,5-6,0, e na temperatura de 50°C. As enzimas purificadas são específicas para trealose e não hidrolisaram avicel, amido, maltose, sacarose, lactose e rafinose. As trealases purificadas exibiram um pl de 3,5 e 3,0 para trealase extracelular e intracelular, respectivamente. A trealase extracelular foi ativada por manganês (50%) e cobalto(14%) e inibida por cálcio (cerca de 42%), alumínio (43%), chumbo (34%), ferro (61 %), mercúrio (66%) e prata (56%). Outros íons não tiveram efeito significante sobre a atividade da enzima extracelular. A trealase intracelular foi ativada por manganês (41 %), cobalto (40%), e prata (31 %). A enzima foi inibida por alumínio (58%), cobre (38%), zinco (57%), chumbo (50%), ferro (71%), EDTA (40%) e mercúrio (100%). Outros íons não exerceram ativação e/ou inibição significante na atividade da enzima intracelular. A trealase extracelular, na presença de 20 mM de manganês, tem sua ativação máxima; enquanto que na presença de cobalto, a enzima necessita de 10 mM. Para enzima intracelular é necessário 40 mM de manganês ou cobalto para sua ativação máxima. A enzima extracelular sofreu uma pequena inibição em presença de ATP, sendo inibida cerca de 9 e 21% nas concentrações de 1 e 10 mM, respectivamente. Na presença de ADP e AMP, na concentração de 1 mM, a enzima extracelular sofreu cerca de 11 % de inibição. A enzima intracelular se mostrou mais sensível aos nucleotídeos fosfatos. Em presença de ATP a enzima sofreu cerca de 23 e 44% de inibição na presença de 1 e 10 mM, respectivamente. ADP 1 mM inibiu a enzima aproximadamente 14%, AMP 1 mM, ADP 10 mM e AMP 10 mM, inibiu aproximadamente 21 % da atividade. Quanto à estabilidade das trealases purificadas frente à temperatura, a trealase extracelular possui uma meia vida quando incubada a 65°Cde aproximadamente 9,8 minutos. Quando incubamos a trealase extracelular na presença de trealose 1 % a 65°C, a enzima praticamente não perde a atividade em até 60 minutos de incubação. A trealase intracelular incubada a 60°C teve uma meia vida de aproximadamente 8 minutos. Quando a trealase intracelular é incubada com trealose 1 %, a sua estabilidade térmica é aumentada para 46 minutos a 55°C. O valor de km encontrado para trealase extracelular foi de 2,72 mM, e a Vmáx foi de 90 U/mg de proteína. O valor de km encontrado para trealase intracelular foi de 4,66 mM, e a Vmáx foi de 90, 90 U/mg de proteína. O conteúdo de carboidrato foi estimado em 19% para enzima extracelular e 66% para a enzima intracelular. Assim, as propriedades exibidas pelas trealases de M. pulchella sugerem a existência de um grupo de trealases que apresentam propriedades mistas, no entanto, as trealases de M. pulchella possuem uma característica particular, elas não são ativadas por cálcio
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 03.08.2007
    • Como citar
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    • ABNT

      PEREIRA, Marita Gimenez. Trealases de malbranchea pulchella var. sulfurea: purificação, propriedades e efetores. 2007. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2007. . Acesso em: 16 abr. 2024.

    • APA

      Pereira, M. G. (2007). Trealases de malbranchea pulchella var. sulfurea: purificação, propriedades e efetores (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.

    • NLM

      Pereira MG. Trealases de malbranchea pulchella var. sulfurea: purificação, propriedades e efetores. 2007 ;[citado 2024 abr. 16 ]

    • Vancouver

      Pereira MG. Trealases de malbranchea pulchella var. sulfurea: purificação, propriedades e efetores. 2007 ;[citado 2024 abr. 16 ]

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