RT-PCR para RNA (-) de picornavírus: desafios de enigma biológico (2007)
- Authors:
- Autor USP: ROSSI, REGINALDO DONIZETI - FMRP
- Unidade: FMRP
- Sigla do Departamento: RBP
- Subjects: PICORNAVIRIDAE; BIOLOGIA MOLECULAR; BIOLOGIA CELULAR
- Language: Português
- Abstract: Os enterovirus são adquiridos pela via oral, replicam-se no intestino e disseminam-se sistemicamente, causando infecções em múltiplos órgãos e tecidos, promovendo diversas manifestações clínicas que consistem de combinações de febre, exantema, miosite unilateral de músculos intercostais (pleurodínia), lesões bolhosas na boca, pés e mãos; além de meningoencefalite, pancreatite, miocardite e hepatite. Os enterovírus, principalmente os CVB, podem estar também associados a manifestações tardias de doença, tal como cardiomiopatia dilatada crônica e diabetes mellitus. O RNA genômico de CVB5, de polaridade positiva, é traduzido em uma poliproteína, que se auto-cliva de modo co-traducional, gerando fragmentos peptídicos, entre os quais uma RNA-polimerase RNA-dirigida que copia o RNA(+) viral em um RNA (-). Este por sua vez, como intermediário replicativo, servirá de molde para a síntese de RNA (+) genômico. Não se conhece em detalhes a cinética de acúmulo de RNA (+) e RNA( -) ao longo do ciclo viral. O desenvolvimento de um ensaio específico que distinga RNA (+) e (-) permitiria identificar replicação viral ativa em doenças tardias, como miocardiopatia dilatada. Este estudo visa desenvolver ensaio de RT-PCR para detectar de forma específica RNA (-) de enterovírus, que seja aplicável a diversos tecidos. Um ensaio de RT-PCR convencional empregando primers diferenciais para RNA (+) e ( -) na etapa de RT mostrou-se inespecífico, produzindo evidência da existência de cDNAformado na ausência de primer durante a transcrição reversa (cDNAprimer(-). Mostramos que a presença de cDNAprimer(-) gera resultados falso-positivos, que podem indicar presença de RNA (-) quando na verdade este não está presente. Para solucionar este problema, desenvolvemos um ensaio de RT -PCR, utilizando na etapa de RT 'primers' biotinilados que nos permitem purificar o cDNA no qual se incorporam por meio de esferas magnéticas conjugadas com streptavidina, para eliminação de cDNAprimer(-). Com isso, conseguimos desenvolver um ensaio de RT -PC R funcional e confiável para detecção específica de RNA (-) de enterovírus em células infectadas. Resultados obtidos nos permitem questionar a validade de resultados anteriormente publicados por outros autores, que não levaram em conta a existência de cDNAprimer(-). A aplicação desse método a grande número de amostras de coração com miocardiopatia dilatada é um exemplo importante da contribuição gerada para estudos de patogênese de infecções enterovirais
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2007
- Data da defesa: 03.05.2007
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ABNT
ROSSI, Reginaldo Donizeti. RT-PCR para RNA (-) de picornavírus: desafios de enigma biológico. 2007. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2007. . Acesso em: 18 set. 2024. -
APA
Rossi, R. D. (2007). RT-PCR para RNA (-) de picornavírus: desafios de enigma biológico (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. -
NLM
Rossi RD. RT-PCR para RNA (-) de picornavírus: desafios de enigma biológico. 2007 ;[citado 2024 set. 18 ] -
Vancouver
Rossi RD. RT-PCR para RNA (-) de picornavírus: desafios de enigma biológico. 2007 ;[citado 2024 set. 18 ]
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