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Tese

Criação de uma endo-xilanase termoestável através da evolução molecular "in vitro" (2006)

  • Autores:
  • Autor USP: RULLER, ROBERTO - FMRP
  • Unidade: FMRP
  • Sigla do Departamento: RBP
  • Assuntos: BIOLOGIA CELULAR; BIOLOGIA MOLECULAR
  • Idioma: Português
  • Resumo: Xilanases (1,4-'beta'-D xilanohidrolases EC 3.2.1.8.são endo-xilanases que hidrolisam aleatoriamente ligações 'beta'-1,4 glicosídicas de xilose da estrutura da xilana (polissacarídeo da hemicelulose da parede celular vegetal) liberando xilooligossacarídeos. Xilanases podem ser usadas alternativamente no lugar de organoclorado durante o branqueamento da polpa de papel no processo Kraft. Para o uso industrial desta enzima é importante que a mesma seja termoestável, e neste sentido a pesquisa tem focado grande esforço para um aumento da atividade catalítica desta enzima em temperaturas elevadas. Com o intuito de entender as bases moleculares da termoestabilidade das xilanases, nós escolhemos uma endo-xilanase do grupo G/11 de Bacillus subtilis linhagem 168 como modelo para um estudo estrutural engenharia de proteínas combinando técnicas de evolução dirigida com análise termodinâmica baseado em técnicas espectroscópicas. O gene para xilanase do grupo G/11 de Bacillus subtilis que codifica um polipeptídeo de 185 resíduos de aminoácidos, foi amplificado por PCR do DNA genômico total de B. subtilis usando dois oligonucleotídeos complementares a região não codante 5' e 3' do lócus xy/A da seqüência genômica do microorganismo. Após a clonagem no vetor pT7BsXA, a proteína heteróloga foi purificada por cromatografia de troca catiônica após precipitação com etanol e diálise do sobrenadante da cultura de células de E.coli transformadas com o vetor. Géis depoliacrilamida (SDS-PAGE) corado com prata, espectrometria de massa, raio hidrodinâmico da molécula, juntamente o sequenciamento N_terminal da proteína (nativa e recombinante), confirmaram a pureza, homogeneidade e o correto processamento pós- traducional da proteína secretada. A proteína recombinante caracterizada teve um pH ótimo em 6,0 e temperatura ótima em 55ºC. O processo de cristalização da molécula foi feito usando técnica de difusão a vapor sendo obtidos (continua) ) monocristais quando a proteína foi equilibrada contra solução-mãe de 1M de tartarato de sódio potássio pH 7.8. Os cristais obtidos foram congelados em 20% de glicerol e os dados de difração de raio-X foram coletados no LNLS (Laboratório Nacional de Luz Sincrotron, Campinas -SP) com um máximo de resolução de 1.8A. A região codiificadora do gene da xilanase nativa foi submetido a reações de mutagênese aleatório usando "error-prone PCR" (epPCR) e a biblioteca aleatória resultante foi selecionada por marcação com vermelho Congo em placas de ágar contendo 1 % de xilano após incubação a 65ºC. Das 90 colônias selecionadas, 16 expressaram mutantes termoestáveis de xilanase e a análise da seqüência de aminoácidos destes mutantes mostraram que todos estes eram combinações de 6 mutações pontuais (Q7H, G13R, S22P, S31Y e S179C) que foi denominada de geração 1 (G1). Os genes dos 6 mutantes de G1 foram submetidos a um segundo ciclo de epPCR e após a varredura de aproximadamente 9.000 clones a75ºC, 7 novos mutantes termoestáveis foram isolados (geração 2 ou G2) (Q7H/S179C, Q7H/S22P, G13R/S179C, Q7HN150A, N61K/S179C, S22P/H156L/S179C e Q7H/G13R/I107L). Posteriormente, ambas as gerações (G1 e G2) foram submetidas a reação de embaralhamento de DNA e novos mutantes foram identificados e selecionados por termo-seleção (thermo-screening) em placas de 96 poços a 85ºC, posteriormente denominada de geração 3 ou G3 (Q7H/H156L/S179C, T3A/Q7H/G13R/S179C, Q7HN61K/P137L/S179C, Q7H/S22P/T126M/H 156L/S 179C, Q7H/G 13R/S22P and Q7H/G 13R/S22P/S 179C). Os melhores mutantes das 3 gerações foram expressados em E.coli, purificados e caracterizados monitorados por mudanças na estrutura secundária por desnaturação térmica. O mapeamento das substituições de aminoácidos das principais mutações obtidas na estrutura cristalina da xilanase nativa de Bacillus subtilis revelaram que muitos dos mutantes estão localizados de dois ) agrupamento (um principal denominado de domínio dedos e outro na 'alfa'-hélice única da molécula. Após análise bioquímica e biofísica dos principais mutantes, o mutante quádruplo (Q7H/G13R/S22P/S179C) foi escolhido como o melhor mutante (Tótima em 75ºC e termotolerância por mais de 5 minutos a 90ºC). Estes resultados sugerem que embora haja múltiplos fatores físico-químicos estejam envolvidos na determinação da termoestabilidade protéica, o contexto estrutural através da qual estas forças agem também são altamente importantes
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 09.03.2006
    • Como citar
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    • ABNT

      RULLER, Roberto. Criação de uma endo-xilanase termoestável através da evolução molecular "in vitro". 2006. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006. . Acesso em: 23 abr. 2024.

    • APA

      Ruller, R. (2006). Criação de uma endo-xilanase termoestável através da evolução molecular "in vitro" (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.

    • NLM

      Ruller R. Criação de uma endo-xilanase termoestável através da evolução molecular "in vitro". 2006 ;[citado 2024 abr. 23 ]

    • Vancouver

      Ruller R. Criação de uma endo-xilanase termoestável através da evolução molecular "in vitro". 2006 ;[citado 2024 abr. 23 ]

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