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Tese

Seqüenciamento nucleotídico completo e estudos associados ao genoma do bunyavirus oropouche (2002)

  • Autores:
  • Autor USP: QUINTANA, VICTOR HUGO AQUINO - FMRP
  • Unidade: FMRP
  • Sigla do Departamento: RBI
  • Assuntos: BUNYAVIRIDAE (ESTUDO); GENOMAS
  • Idioma: Português
  • Resumo: O vírus Oropouche (ORO) que pertence ao gênero Bunyavirus da família Bunyaviridae, é o agente causador da febre do Oropouche, a segunda arbovirose em número de casos humanos no Brasil, A importância desta virose levou-nos a determinar, de forma inédita, a seqüência completa dos segmentos de RNA L, M e S de ORO cepa BeAn1991. Para obtenção individual de cada um dos três segmentos de RNA, desenvolvemos método simples que incluia precipitação das partículas virais, purificação do RNA e eletroforese deste em gel de agarose a partir do qual os segmentos de RNA foram recuperados. O segmento S de ORO foi amplificado por RT- PCR utilizando primer único desenhado com base na seqüência 3' do segmento S do vírus Bunyamwera (protótipo do gênero). O seqüenciamento mostrou um segmento S com 754 nucleotídios tendo duas regiões codificantes (ORF) sobrepostas no sentido complementar, as quais codificam a proteína N com 231 aminoácidos e a proteína NSs com 91 aminoácidos. Também, possui duas regiões não codificantes, uma na extremidade 5' (RNC5') de 44 nucleotídios e outra na extremidade 3' (RNC3') de 17 nucleotídios. Para seqüenciamento do segmento M utilizamos um método de genomic walking em duas etapas: amplificação linear (AL) seguida de uma PCR com primer único (PCR - PU). O segmento M possui 4385 nucleotídios com uma ORF no sentido complementar flanqueada por uma RNC5' de 31 nucleotídios e RNC3' de 94 nucleotídios. A ORF codifica a poliproteína de 1420 aminoácidos que,após clivagem, gera as glicoproteínas G1 e G2, e a proteína NSm. O método de Genomic walking em duas etapas mostrou-se adequada no caso do segmento M de ORO e poderia ser usado na obtenção de seqüências desconhecidas de DNA adjacentes a regiões curtas e conhecidas de vírus com genômas mais complexos conforme confirmamos ao testá-la para citomegalovirus. A seqüência do segmento L de ORO foi obtida processando cDNAs sobrepostos. Esta possui 6846 ) nucleotídios com uma ORF no sentido complementar que codifica a proteína L de 2250 aminoácidos. A ORF está flanquada de uma RNC5' de 43 nucleotídios e de uma RNC3' de 53 nucleotídios. A seqüência de aminoácidos da proteína L de ORO foi alinhada com a de outros vírus da família Bunyaviridae, bem como com a proteína PB1 do vírus influenza. PB1 possui 4 sítios ativos descritos: os sítios de ligação às extremidades 5' e 3' do RNA viral (5'vRNA e 3'vRNA), o de atividade endonuclease para a produção de cap-primer, e o de catálise para adição de nucleotídios. O alinhamento mostrou que a proteína L de ORO possui as três regiões características da RNA polimerase dos vírus de polaridade negativa, e também uma quarta região conserva Também, o alinhamento permitiu inferir a localização na proteína L dos vírus da família Bunyaviridae os quatro sítios da proteína PBl dos vírus da influenza. Os sítios de ligação da 5'vRNA e o de atividade endonuclease para produção de cap-primer estão localizados na quarta regiãoconservada da proteína L indicando que exerceriam papel importante na função desta proteína. Finalmente, a proteína N de ORO foi expressa em E. coli e mostrou-se corretamente montada por apresentar tamanho esperado, de 26 kd, à eletroforese em gel de poliacrilamida e por ter sido reconhecida no immunobloting por anticorpos policlonais. A seqüência nucleotídica completa dos três segmentos de RNA de ORO descrita neste estudo deverá ser de muita utilidade para a síntese de primers específicos a serem utilizados numa RT-PCR para o diagnóstico e estudo da epidemiologia moleculara desta virose. Também, a produção de proteínas virais recombinantes de ORO, tal como a proteína N, poderam ser utilizadas como atígenos para o desenvolvimento de métodos de diagnósticos sorológicos ou como candidatas a vacinas
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 17.07.2002
    • Como citar
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    • ABNT

      QUINTANA, Victor Hugo Aquino. Seqüenciamento nucleotídico completo e estudos associados ao genoma do bunyavirus oropouche. 2002. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2002. . Acesso em: 19 abr. 2024.

    • APA

      Quintana, V. H. A. (2002). Seqüenciamento nucleotídico completo e estudos associados ao genoma do bunyavirus oropouche (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.

    • NLM

      Quintana VHA. Seqüenciamento nucleotídico completo e estudos associados ao genoma do bunyavirus oropouche. 2002 ;[citado 2024 abr. 19 ]

    • Vancouver

      Quintana VHA. Seqüenciamento nucleotídico completo e estudos associados ao genoma do bunyavirus oropouche. 2002 ;[citado 2024 abr. 19 ]

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