Purificação de uma Aminopeptidase do dinoflagelado marinho Gonyaulax polyedra (1998)
- Autores:
- Autor USP: SANKIEVICZ, DANIELA - IQ
- Unidade: IQ
- Sigla do Departamento: QBQ
- Assuntos: BIOQUÍMICA; ENZIMAS (METABOLISMO)
- Idioma: Português
- Resumo: A participação de proteases na regulação da disponibilidade e atividade de proteínas regulatórias centrais do metabolismo celular foi negligenciada por muitos anos. Atualmente, a importância da degradação seletiva de proteínas intercelulares é cada vez mais evidente e reconhecida como etapa fundamental na regulação de diversos processos biológicos (Wolf, 1992). A degradação de proteínas regulatórias, é quase sempre presente como um componente regulador de mecanismos que envolvam controle temporal, como por exemplo, ciclo celular, vias de transdução de sinal, embriogenesis e ritmos circadianos ( Hochstrasser, 1995). A principal via de degradação seletiva em eucariontes é a via dependente de ubiquitina e ATP (Hershko, 1996). O dinoflagelado marinho Gonyaulax polyedra manifesta uma variedade de ritmos circadianos, sendo seu ritmo de bioluminescência o mais conhecido e estudado (Morse et al, 1990). A concentração intracelular e atividade de dois componentes da reação de luminescência em G. polyedra, a enzima luciferase e a LBP, variam circadianamente, sendo esta variarão resultado da degradação e síntese de novo das proteínas a cada período de 24 horas (Morse et al, 1989). Aminopeptidases são exopeptidases que catalisam a remoção de resíduos amino-terminais de proteínas e peptídeos. Dentre as funções propostas para estas enzimas, destacamos seu possível envolvimento na via de degradação seletiva de ubiquitina e ATP. Aminopeptidases são capazes de removerresíduos amino-terminais com diferentes velocidades, podendo modificar diferencialmente a região amino-terminal de substratos protéicos e peptídicos e desta maneira regular a velocidade com que seus substratos são degradados (Taylor, 1993a). A natureza do resíduo amino-terminal é um dos sinais de degradação reconhecidos pelo sistenm ubiquitina-proteassomo (Bachniair etal, 1986). As aminopeptidases que removem preferencialmente resíduos de leucina ou resíduos de ) natureza hidrofóbica são denominadas leucina-aminapeptidases (LAP). Além do possível envolvimento na via de degradação de ubiquitina, esta família de aminopeptidases é interessante de ser estudada por si só, pois constitui a única família de aminopeptidases cuja sequência primária é muito conservada durante a evolução, desde de bactéria até- mamíferos. A atividade para o substrato LpNA foi caracterizada e purificada em G. polyedra. Determinamos valores de pH e temperatura ótimos para atividade do enzima, sendo os valores encontrados iguais a 7.0 e '37 GRAUS'C, respectivamente. O Km aparente calculado pelo programa Enzifitter foi de 0.14mM. A proteína caracterizada possui pI6.8, peso molecular de aproximadamente l2OkDa em condições não desnaturantes e 55kba em condições desnaturantes. É inibida pelos quelantes de metais, EDTA e 1,10-phenatrolina e pelos ions de metais Zri+2 e Cu+2. Ca+2, Co+2, Mg+2 e Mn+2 em concentrações inferiores a 2mM não afetam a atividade da enzima. Com exceção do Mg+2, osdemais íons de metais, quando em concentraçoes superiores a 2mM, inibem a enzima. Os resultados indicam que a aminopeptidase caracterizada possui mais de uma subunidade e é uma metaloprotease. Estas características corroboram o que está descrito no literatura para aminopeptidase com atividade para LPNA. A aminopeptidase de G. polyedra foi purificada utilizando-se sucessivas etapas cromatográficas. Após a última etapa do processo de purificação, a atividade de aminopeptidase coelui com um polipeptídeo de 55kDa, revelado como uma banda única em SDS-PAGE corado com prata. Esta proteína purificada é reconhecida pelo anticorpo policlonal anti-LAP produzido em nosso laboratório a partir de uma leucina-aminopeptidase comercial. A proteína purificada foi enviada para identificação por espectrometria de massa, pelo método MALDI. A proteína purificada foi identificada corno um leucil aminapeptidase
- Imprenta:
- Data da defesa: 03.12.1998
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ABNT
SANKIEVICZ, Daniela. Purificação de uma Aminopeptidase do dinoflagelado marinho Gonyaulax polyedra. 1998. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 1998. . Acesso em: 19 set. 2024. -
APA
Sankievicz, D. (1998). Purificação de uma Aminopeptidase do dinoflagelado marinho Gonyaulax polyedra (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, São Paulo. -
NLM
Sankievicz D. Purificação de uma Aminopeptidase do dinoflagelado marinho Gonyaulax polyedra. 1998 ;[citado 2024 set. 19 ] -
Vancouver
Sankievicz D. Purificação de uma Aminopeptidase do dinoflagelado marinho Gonyaulax polyedra. 1998 ;[citado 2024 set. 19 ]
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