Reparo e mutagênese de lesões de DNA induzidas por oxigênio singlete (1998)
- Autores:
- Autor USP: LIMA, LUCYMARA FASSARELA AGNEZ - IB
- Unidade: IB
- Sigla do Departamento: BIO
- Assunto: GENÉTICA
- Idioma: Português
- Resumo: Para avaliar os efeitos dos danos genotóxicos induzidos por oxigênio singlete ('ANTIPOT.1 O IND.2') no DNA foram adotados diferentes procedimentos, que incluem o tratamento de bactérias, de DNA plasmidial e de um oligonucleotídeo (posteriormente usado para construção de vetor modificado em seqüência específica) com o endoperóxido do sal 3,3'-(1,4-nafitilideno)diproprionato dissódico (NDP'O IND.2'), que por termodissociação libera 'ANTIPOT.1 O IND.2'. Após o tratamento de bactérias, selvagem e deficientes nas enzimas de reparo formamidopirimidina-DNA-glicosilase (FPG) e/ou MutY-glicosilase, com NDP'O IND.2', foi observada morte celular similar em todas as cepas testadas, porém, observou-se aumento na freqüência de mutações nos genes lacZ e rif apenas nas cepas deficientes em reparo de DNA. Os dados sugerem que o 'ANTIPOT.1 O IND.2' é capaz de induzir lesões no material genético bacteriano, as quais são substrato para ação das enzimas FPG e MutY-glicosilase. Embora, as lesões reconhecidas por essas vias de reparo de DNA tenham grande potencial mutagênico, elas não estão envolvidas com a mortee celular causada por 'ANTIPOT.1 O IND.2'. A análise da freqüência de mutações induzidas no gene supF do vetor pAC189, após o tratamento in vitro do DNA plasmidial com NDP'O IND.2' e replicação em cepas selvagem e deficientes nas enzimas de reparo de DNA FPG ou exonuclease III, revelou um aumento na taxa mutacional em todas as cepas testadas. As cepas deficientes em reparode DNA apresentaram freqüência de mutações significativamente maior do que a cepa selvagem, sugerindo a participação das enzimas FPG e exonuclease III no reparo de danos induzidos por 'ANTIPOT.1 O IND.2'. A cepa deficiente em exonuclease III apresentou níveis de mutagênese extremamente elevados (na ordem de 10%). No entanto, a análise das curvas de crescimento de cepas selvagem e deficientes em exonuclease III, transformadas com vetores carregando o gene ) supF selvagem (supF+) ou mutado (supF-), revelou que nas cepas deficientes em exonuclease III o gene supF+ retarda o crescimento, ocorrendo desta forma, um crescimento preferencial de cepas transformadas com vetores supF- em relação aos vetores supF+. Esse fenômeno mascarou a freqüência real de mutações induzidas por 'ANTIPOT.1 O IND.2' em DNA replicado em cepas deficientes em exonuclease III. Foram seqüenciados 62 mutantes independentes no gene supF+, após replicação do DNA lesado por 'ANTIPOT.1 O IND.2' em cepa deficiente em exonuclease III. O espectro de mutações obtido revelou alta freqüência de substituições de base envolvendo guaninas, alvo primário do 'ANTIPOT.1 O IND.2', sendo as transversões GC-TA o tipo de mutação mais freqüente (54,9%), seguidas das transversões GC-CG (30,7%). A ocorrência de transversões GC-TA em DNA lesado por 'ANTIPOT.1 O IND.2' tem sido atribuída à presença da 8-oxo-7-hidrodesoxiguanosina (8-oxodG), principal lesão de DNA induzida por este agente, já a lesão responsávelpelas transversões GC-CG não é conhecida. Em uma análise mais específica, foi feito o tratamento de uma seqüência de 14 nucleotídeos (contendo apenas três guanosinas justapostas) com NDP'O IND.2', que a seguir, foi inserida em plasmídeo, originando o vetor pucSmaN, que foi usado para transformação em bactérias selvagem e deficientes em enzimas de reparo de DNA e posterior análise da freqüência de mutações na seqüência lesada por 'ANTIPOT.1 O IND.2'. Foi observada indução de mutagênese em todas as cepas testadas, porém as cepas BH20(fpg), AYM57(fpg mutY) e AYM84(fpg mutY uvrC) apresentaram aumento na freqüência de mutações significativamente superior à cepa selvagem, sendo que os níveis mais altos foram observados na cepa duplo mutante. O sequenciamento dos mutantes obtidos revelou alta freqüência das transversões GC-TA e GC-CG. Os dados sugerem que as enzimas FPG e MutY-glicosilase são importantes ) para o reparo das lesões induzidas por 'ANTIPOT.1 O IND.2', por neutralizar o potencial mutagênico da 8-oxodG, lesão responsável pelas transversões GC-TA, e provavelmente, da outra lesão envolvida na ocorrência das transversões GC-CG, contribuindo para redução da ocorrência de mutações. A presença do sistema UvrABC parece favorecer a ocorrência de mutações em cepas deficientes em FPG e MutY-glicosilase. A análise do espectro de mutações revelou ainda uma predominância de tranversões GC-TA na primeira guanina e de GC-CG na terceira guanina da seqüência alvo doplasmídeo pucSman, sugerindo que o tipo de lesão de DNA induzida por 'ANTIPOT.1 O IND.2' possa estar relacionada ao contexto da seqüência atacada, ou que o processamento dessas lesões, realizado pelos sistemas de reparo, seja diferente em função do mesmo. Finalmente, testamos a capacidade do 'ANTIPOT.1 O IND.2' de interferir em respostas bacterianas ao regulon soxRS. Para isso, foi realizado o tratamento de cepas bacterianas, contendo construções onde o promotor soxS foi ligado ao gene lacZ, com NDP'O IND.2'. Desta forma, foi possível detectar a indução do regulon soxRS através do aumento da atividade de 'beta'-galactosidase. Foi observado que o 'ANTIPOT.1 O IND.2' é capaz de induzir a atividade de soxS de maneira dependente da presença da proteína SoxR, assim como, previamente descrito para a ocorrência de estresse oxidativo causado pela presença de 'O IND.2'. Neste trabalho foi demonstrado que as lesões de DNA induzidas por 'ANTIPOT.1 O IND.2' apresentaram um grande potencial mutagênico e que a atividade das enzimas de reparo de DNA FPG e MutY-glicosilase é fundamental na prevenção destas mutações, agindo não só sobre a 8-oxodG, como previamente descrito, mas possivelmente também, sobre a lesão responsável pela ocorrência das transversões GC-CG. Além disso, foi sugerido que o sistema de reparo de DNA UvrABC pode contribuir com o aumento ) na freqüência de mutações em cepas deficientes em FPG e MutY-glicosilase. Os danos induzidos por 'ANTIPOT.1 O IND.2' podem serdependentes do contexto da seqüência atacada. Outro fato interessante aqui demonstrado é a capacidade do 'ANTIPOT.1 O IND.2' em induzir resposta bacteriana ao estresse oxidativo, caracterizada pela ativação do regulon soxRS. Tal resposta havia sido previamente demonstrada para outras espécies ativas de oxigênio, sendo esta a primeira vez que foi relacionada à presença de 'ANTIPOT.1 O IND.1'
- Imprenta:
- Data da defesa: 02.09.1998
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ABNT
LIMA, Lucymara Fassarela Agnez. Reparo e mutagênese de lesões de DNA induzidas por oxigênio singlete. 1998. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 1998. . Acesso em: 23 abr. 2024. -
APA
Lima, L. F. A. (1998). Reparo e mutagênese de lesões de DNA induzidas por oxigênio singlete (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. -
NLM
Lima LFA. Reparo e mutagênese de lesões de DNA induzidas por oxigênio singlete. 1998 ;[citado 2024 abr. 23 ] -
Vancouver
Lima LFA. Reparo e mutagênese de lesões de DNA induzidas por oxigênio singlete. 1998 ;[citado 2024 abr. 23 ]
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